影响电泳的基本因素有哪些
影响电泳的基本因素有
1.电泳介质的pH值
溶液的pH值决定带电物质的解离程度,也决定物质所带净电荷的多少。对蛋白质,氨基酸等类似两性电解质,pH值离等电点越远,粒子所带电荷越多,泳动速度越快,反之越慢。因此,当分离某一种混合物时,应选择一种能扩大各种蛋白质所带电荷量差别的pH值,以利于各种蛋白质的有效分离。为了保证电泳过程中溶液的pH值恒定,必须采用缓冲溶液。
2.缓冲液的离子强度
溶液的离子强度(Ion intensity)是指溶液中各离子的摩尔浓度与离子价数平方的积的总和的1/2。带电颗粒的迁移率与离子强度的平方根成反比。低离子强度时,迁移率快,但离子强度过低,缓冲液的缓冲容量小,不易维持pH恒定。高离子强度时,迁移率慢,但电泳谱带要比低离子强度时细窄。通常溶液的离子强度在0.02~0.2之间。
I=1/2∑CiZi2 (I:离子强度Ci:离子的摩尔浓度Zi:离子价数.)
0.154M NaCl溶液的离子强度为:
I= 1/2(0.154×12+0.154×12)=0.154
0.015M Na2SO4溶液的离子强度为:
I= 1/2(0.015×2×12+0.015×22)=0.045
3.电场强度
电场强度(电势梯度Electric field intensity)是指每厘米的电位降(电位差或电位梯度)。电场强度对电泳速度起着正比作用,电场强度越高,带电颗粒移动速度越快。根据实验的需要,电泳可分为两种:一种是高压电泳,所用电压在500~1000V或更高。由于电压高,电泳时间短(有的样品需数分钟),适用于低分子化合物的分离,如氨基酸,无机离子,包括部分聚焦电泳分离及序列电泳的分离等。因电压高,产热量大,必须装有冷却装置,否则热量可引起蛋白质等物质的变性而不能分离,还因发热引起缓冲液中水分蒸发过多,使支持物(滤纸,薄膜或凝胶等)上离子强度增加,以及引起虹吸现象(电泳槽内液被吸到支持物上)等,都会影响物质的分离。另一种为常压电泳,产热量小,室温在10~25℃分离蛋白质标本是不被破坏的,无需冷却装置,一般分离时间长。
4.电渗现象